本研究團隊在表面電漿子共振生物感測器的研究已有多項平台技術開發，分別為表面電漿子晶片製程設計與製造、光機自動化整合與核酸適體生物分子探針設計與驗證三大部分。
本實驗室團隊前期致力於無須溫度循環的恆溫核酸放大擴增方法研發，除了已發展需要有聚合酶參與反應的環形恆溫擴增(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP)反應外[1]，也接續發展具有無須TaqMan聚合酶且可在室溫下操作的恆溫鏈式反應(Hybridization Chain Reaction, HCR)，並針對新冠病毒（SARS-CoV-2）N1/N2/N3與人類RNase P. 基因位點，提出一個應用在設計恆溫擴增探針序列與結構最佳化的演算法與驗證[2]。
本論文則首次結合以創新相位式SPR (Phase SPR, pSPR)影像量測系統與使用前期所設計演算法，應用於檢測癌症細胞外泌體上的a6b4整合素(Integrin)的 HCR核酸適體探針設計與在室溫下進行擴增反應的訊號驗證。如圖一所示，在光機系統上透過一個YVO4雙折射晶體，造成在同光徑入射光的P與S極化光的相位延遲差異，此一入射光進入SPR晶片時，因為只有P極化光會在共振角度下與金薄膜表面固定的附著分子有離開金屬薄膜表面的交互作用，而S極化光則因平行於表面而沒有交互作用，這兩道不同極化狀態的光一起在全反射路徑上，經分析偏振片進入影像偵測器後，可藉由軟體鎖相分析演算法計算，獲得P與S因為與生物分子交互作用引起的相位差干涉角度與強度訊號，作為分子動態反應的高靈敏度分析方法。在圖二示意圖中，顯示經事先將10T + I啟動子片段固定於金膜表面，在加入混有H1與H2的HCR自組裝恆溫擴增放大機制過程，進一步利用pSPR相位檢測分子動態行為。實驗分析中引入利用三個不同濃度與折射率的食鹽水作為常規化的依據，以降低不同晶片間因為製程厚度不均所引起的強度差異，以降低訊號變異度，而在後續的HCR反應動態檢測過程中，可觀察到在依序加入引發劑與500 nM H1結合反應30分鐘後僅有些微變化，經30分鐘洗滌步驟後標記A，加入H1和H2一比一混合溶液後30分鐘的時間點標記B.（A+B）/A=6.5，兩者的反應在30分鐘時的檢測量值達6.5倍的差異。（B）結合pSPR和DNA凝膠電泳結果。可以觀察到HCR複合物在相同反應時間（30分鐘）下的長度差異。而進一步在圖四中顯示在NaCl溶液校正後，HCR隨H1、H2反應物濃度不同的劑量反應(藍色：1 μm H1+ 1 μm H2，紅色：500 nM H1 + 500 nM H2，黑色：250 nM H1 + 250 nM H2)具有很好的正相關性。通過將HCR與pSPR測試的適配體擴增放大反應，不僅證明此一檢測平臺具有簡單可實施的技術優點，更具有相位訊號檢測的高靈敏度與強度訊號所具有的大動態量測範圍，未來可以適用於更多樣化的識別事件。（醫工系林啟萬教授提供）
[1] S.-Y. Lee, C.-N. Lee, H. Mark, D. R. Meldrum, and C.-W. Lin, "Efficient, specific, compact hepatitis B diagnostic device: Optical detection of the hepatitis B virus by isothermal amplification," Sensors and Actuators, B: Chemical, vol. 127, no. 2, pp. 598-605, 2007 2007, doi: 10.1016/j.snb.2007.05.015.
[2] T. H. Wu, C. C. Chang, C. H. Yang, W. Y. Lin, T. J. Ee, and C. W. Lin, "Hybridization Chain Reactions Targeting the Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2)," Int J Mol Sci, vol. 21, no. 9, May 1 2020, doi: 10.3390/ijms21093216.
圖一、（A） 相位表面電漿子共振（pSPR）系統的光路架構圖。（B）入射光經雙折射晶體YVO4前後在共光徑上的P與S偏振光上造成的相位差異。（C）以PDMS實現的三流道SPR晶片。（D）隨入射角掃描變化在SPR相位角的變化。
圖二、結合HCR自組裝恆溫擴增放大機制在pSPR金表面相位檢測平臺上的HCR-pSPR反應示意圖。
圖三、HCR反應的時間檢測。在pSPR動態量測結果中，顯示依序加入引發劑與500 nM H1結合反應30分鐘後僅有些微變化，經30分鐘洗滌步驟後標記A，加入H1和H2一比一混合溶液後30分鐘的時間點標記B.（A+B）/A=6.5，表示30分鐘時檢測量值為6.5倍。（B）結合pSPR和DNA凝膠電泳結果。可以觀察到HCR複合物在相同反應時間（30分鐘）下的長度隨濃度變化的差異。
圖四、不同核酸適體濃度和離子強度環境下的HCR反應結果。在以三個已經濃度與折射率的NaCl溶液校正後，（A）H1、H2 的濃度和隨後的 HCR 擴增成正比：當 H1 和 H2 的濃度增加時，HCR 擴增增加。藍色：1 m H1+ 1 m H2，紅色：500 nM H1 + 500 nM H2，黑色：250 nM H1 + 250 nM H2。